1.基本說(shuō)明

真核生物DNA存在較多“十字型”、“Z字型”等二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)，這種DNA結(jié)構(gòu)在利用傳統(tǒng)大腸桿菌進(jìn)行克隆時(shí)易被大腸桿菌體內(nèi)的重組酶系統(tǒng)或其他防御系統(tǒng)識(shí)別并對(duì)其進(jìn)行重組，刪除等破壞，導(dǎo)致很難對(duì)這類(lèi)DNA進(jìn)行正確的克隆操作。SURE菌株可以解決這些問(wèn)題：此菌株體內(nèi)重組酶系統(tǒng)整條通路被破壞，并且 (McrA-, McrCB-, McrF-, Mrr-, HsdR-)這些限制性突變的存在賦予此菌株無(wú)法對(duì)外源DNA進(jìn)行標(biāo)記、限制，提高了外源甲基化DNA的克隆效率，同時(shí)具有核酸酶 (endA)突變、重組酶 (recB recJ)突變，增強(qiáng)了外源DNA的穩(wěn)定性。存在于F′因子上的lacIqZΔM15基因使此菌株可以進(jìn)行藍(lán)白斑篩選；Kanr，Tetr賦予菌株卡那霉素和四環(huán)素抗性。SURE感受態(tài)細(xì)胞由特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率達(dá)5×108 cfu/μg DNA。

2.基因型
E. coli B e14-(mcrA-) Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 endA1 gyrA96 thi-1 supE44 relA1 lac recB recJ sbcC umuC::Tn5 (Kanr) uvrC [F′ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (TetR)]

3.儲(chǔ)存及使用環(huán)境

本產(chǎn)品應(yīng)保存在-80℃，不可反復(fù)凍融或放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

進(jìn)行轉(zhuǎn)化過(guò)程中，請(qǐng)根據(jù)相應(yīng)溫度及無(wú)菌條件的要求進(jìn)行。

4.操作方法

(1).SURE感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA (質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物) 并用手撥打EP管底輕輕混勻 (避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。

(2).42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

(3). 向離心管中加入700μl不含抗生素的無(wú)菌培養(yǎng)基 (2YT或LB)，混勻后37℃，200rpm復(fù)蘇60分鐘。

(4). 5000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。(

(5). 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。

5.注意事項(xiàng):

(1).感受態(tài)細(xì)胞最好在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間存放會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

(2). 混入質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物時(shí)應(yīng)輕柔操作。

(3). 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?；蚋咝实倪B接產(chǎn)物可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。

(4). 此菌株具有卡那霉素，四環(huán)素抗性，擁有這兩種抗性的質(zhì)粒無(wú)法使用；對(duì)<40 μg/ml氯霉素有抗性，但對(duì)100 μg/ml氯霉素敏感。使用其他抗生素參考濃度：氨芐青霉素 (終濃度: 100 μg/ml），氯霉素 (終濃度: 100 μg/ml)。

(5).SURE感受態(tài)細(xì)胞采用常規(guī)轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)5×108 cfu/μg DNA。如果有更高要求，可嘗試Stratagene公司推薦的標(biāo)準(zhǔn)protocol。