1.基本說明
真核生物DNA存在較多“十字型”、“Z字型”等二級或三級結(jié)構(gòu),這種DNA結(jié)構(gòu)在利用傳統(tǒng)大腸桿菌進行克隆時易被大腸桿菌體內(nèi)的重組酶系統(tǒng)或其他防御系統(tǒng)識別并對其進行重組,刪除等破壞,導(dǎo)致很難對這類DNA進行正確的克隆操作。SURE菌株可以解決這些問題:此菌株體內(nèi)重組酶系統(tǒng)整條通路被破壞,并且 (McrA-, McrCB-, McrF-, Mrr-, HsdR-)這些限制性突變的存在賦予此菌株無法對外源DNA進行標(biāo)記、限制,提高了外源甲基化DNA的克隆效率,同時具有核酸酶 (endA)突變、重組酶 (recB recJ)突變,增強了外源DNA的穩(wěn)定性。存在于F′因子上的lacIqZΔM15基因使此菌株可以進行藍白斑篩選;Kanr,Tetr賦予菌株卡那霉素和四環(huán)素抗性。SURE感受態(tài)細胞由特殊工藝制作,pUC19質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率達5×108 cfu/μg DNA。
2.基因型
E. coli B e14-(mcrA-) Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 endA1 gyrA96 thi-1 supE44 relA1 lac recB recJ sbcC umuC::Tn5 (Kanr) uvrC [F′ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (TetR)]
3.儲存及使用環(huán)境
本產(chǎn)品應(yīng)保存在-80℃,不可反復(fù)凍融或放置時間過長,否則會降低轉(zhuǎn)化效率。
進行轉(zhuǎn)化過程中,請根據(jù)相應(yīng)溫度及無菌條件的要求進行。
4.操作方法
(1).SURE感受態(tài)細胞從-80℃拿出,迅速插入冰中,5分鐘后待菌塊融化,加入目的DNA (質(zhì)?;蜻B接產(chǎn)物) 并用手撥打EP管底輕輕混勻 (避免用槍吸打),冰中靜置25分鐘。
(2).42℃水浴熱激45秒,迅速放回冰上并靜置2分鐘,晃動會降低轉(zhuǎn)化效率。
(3). 向離心管中加入700μl不含抗生素的無菌培養(yǎng)基 (2YT或LB),混勻后37℃,200rpm復(fù)蘇60分鐘。
(4). 5000rpm離心一分鐘收菌,留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。(
(5). 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。
5.注意事項:
(1).感受態(tài)細胞最好在冰中緩慢融化,插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA,不可在冰中放置時間過長,長時間存放會降低轉(zhuǎn)化效率。
(2). 混入質(zhì)粒或連接產(chǎn)物時應(yīng)輕柔操作。
(3). 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒或高效率的連接產(chǎn)物可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。
(4). 此菌株具有卡那霉素,四環(huán)素抗性,擁有這兩種抗性的質(zhì)粒無法使用;對<40 μg/ml氯霉素有抗性,但對100 μg/ml氯霉素敏感。使用其他抗生素參考濃度:氨芐青霉素 (終濃度: 100 μg/ml),氯霉素 (終濃度: 100 μg/ml)。
(5).SURE感受態(tài)細胞采用常規(guī)轉(zhuǎn)化方法,轉(zhuǎn)化效率可達5×108 cfu/μg DNA。如果有更高要求,可嘗試Stratagene公司推薦的標(biāo)準(zhǔn)protocol。