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EHA105(pSoup)感受態(tài)細(xì)胞

1基本說明

EHA105菌株由EHA101菌株改造而來,為C58型背景,核基因中含有篩選標(biāo)簽——利福平抗性基因rif,為了便于轉(zhuǎn)化操作,此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的琥珀堿型Ti質(zhì)粒pEHA105 (pTiBo542DT-DNA),此質(zhì)粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件,pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞,但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移)。在EHA105菌株中轉(zhuǎn)入help質(zhì)粒:pSoup即為EHA105 (pSoup)菌株,可幫助pGreen,62SK,pGs2系列質(zhì)粒在農(nóng)桿菌中復(fù)制,同時(shí)賦予該菌株四環(huán)素(tet)抗性,適用于水稻、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作。本公司生產(chǎn)的EHA105(pSoup)化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作,pGs2(卡那霉素抗性)質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>104 cfu/μg DNA。

2基因型

C58 (rifR) Ti pEHA105 (pTiBo542DT-DNA) Succinamopine (pSoup-tetR)

3儲(chǔ)存及使用環(huán)境

1.本產(chǎn)品應(yīng)保存在-80℃,不可反復(fù)凍融或放置時(shí)間過長,否則會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

2.進(jìn)行轉(zhuǎn)化過程中,請(qǐng)根據(jù)相應(yīng)溫度及無菌條件的要求進(jìn)行。

4操作方法

1.取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)于室溫或手心片刻待其部分融化,處于冰水混合狀態(tài)時(shí)插入冰中。

2.每100μl感受態(tài)加入0.01-1μg質(zhì)粒DNA(轉(zhuǎn)化效率較高,第一次使用前最好做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定所加質(zhì)粒的量),用手撥打管底混勻,依次于冰上靜置5分鐘、液氮5分鐘、37℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。

3.加入700μl無抗生素的LB或YEB液體培養(yǎng)基,于28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時(shí)。

4. 6000 rpm離心一分鐘收菌,留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上,倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天

(當(dāng)平板只含有50μg/ml kan時(shí),28℃培養(yǎng)48 h即可;平板中同時(shí)加入50μg/ml kan,20μg/ml rif時(shí),需28℃培養(yǎng)60 h;如果使用的平板含有50μg/ml rif則需要28℃培養(yǎng)72-90 h)。 

5注意事項(xiàng)

1.加入質(zhì)粒時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10;質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機(jī)物污染,轉(zhuǎn)化效率急劇下降;質(zhì)粒增大一倍,轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。

2.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)??上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量,本公司生產(chǎn)的EHA105(pSoup)化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞具有四環(huán)素抗性,但在轉(zhuǎn)入目標(biāo)質(zhì)粒涂板篩選陽性克隆時(shí),只需加入目標(biāo)質(zhì)??剐缘目股?,不加四環(huán)素。
3.平板上陽性克隆密度過大時(shí),由于營養(yǎng)不足,陽性克隆生長變慢,菌落變小,為了獲得大的菌落,應(yīng)減少質(zhì)粒用量。

4.利福平濃度不應(yīng)高于25μg/ml,過高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長,會(huì)降低其生長速度和轉(zhuǎn)化效率。

5.培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農(nóng)桿菌;根據(jù)所用菌株抗性加入鏈霉素或慶大霉素可防止Ti質(zhì)粒丟失,但鏈霉素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作,培養(yǎng)農(nóng)桿菌時(shí)不考慮鏈霉素或慶大霉素,Ti質(zhì)粒丟失的概率極低(可以忽略)。