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Stbl3感受態(tài)細(xì)胞

基因型

F- mcrB mrr hsdS20(rB-, mB-) recA13 supE44 ara-14 galK2 lacY1 proA2 rpsL20 (StrR) xyl-5 λ-leu mtl-1 endA1+


產(chǎn)品說明

Stbl3菌株來源于 HB101 E. coli strain,是慢病毒載體系統(tǒng)推薦使用的菌株?;蚪M含有重組酶recA13突變,可有效抑制長片段末端重復(fù)區(qū)的重組,降低錯誤重組的概率;但不含核酸酶endA1突變,體內(nèi)核酸酶含量較高,提取質(zhì)粒時務(wù)必使用質(zhì)粒提取試劑盒中去蛋白液。此菌株具有鏈霉素抗性,不存在lacIqZΔM15,不可用于藍(lán)、白斑篩選。Stbl3感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作,pUC19檢測轉(zhuǎn)化效率>108cfu/μg DNA。 


操作方法

1. Stbl3感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出,迅速插入冰中,5分鐘后待菌塊融化,加入目的DNA (質(zhì)?;蜻B接產(chǎn)物) 并用手撥打EP管底輕輕混勻 (避免用槍吸打),冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒,迅速放回冰上并靜置2分鐘,晃動會降低轉(zhuǎn)化效率。

3. 向離心管中加入0.9 mL室溫S.O.C.或LB培養(yǎng)基(S.O.C.營養(yǎng)豐富,可提高轉(zhuǎn)化效率)。

4. 37℃,225 rpm復(fù)蘇60分鐘或30℃,225 rpm復(fù)蘇90分鐘。

(當(dāng)質(zhì)粒中含有不穩(wěn)定片段時,30℃培養(yǎng)可降低錯誤重組的概率,若轉(zhuǎn)化control pUC19計算轉(zhuǎn)化效率,則需37℃,225 rpm復(fù)蘇60分鐘)

5. 5000rpm離心一分鐘收菌,留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的S.O.C. 或LB培養(yǎng)基上。

6. 將平板倒置放于37℃或30℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

(當(dāng)質(zhì)粒中含有不穩(wěn)定片段時,30℃培養(yǎng)可降低錯誤重組的概率,若轉(zhuǎn)化control pUC19計算轉(zhuǎn)化效率,則需37℃培養(yǎng)過夜)


注意事項(xiàng)

1. 對不穩(wěn)定DNA片段的克隆或逆轉(zhuǎn)錄病毒/慢病毒載體的構(gòu)建,涂板后平板應(yīng)在30℃培養(yǎng),以減少發(fā)生錯誤重組的概率。

2. 制備高純度病毒質(zhì)粒時,應(yīng)使用新鮮轉(zhuǎn)化的平板接菌,新鮮菌液提取質(zhì)粒,菌液不可低溫保存后使用。

3. 對不穩(wěn)定的克隆或病毒質(zhì)粒優(yōu)先以質(zhì)粒狀態(tài)保存,盡量避免將質(zhì)粒保存在大腸桿菌細(xì)胞中。

4. S.O.C.或LB培養(yǎng)基均可使用,S.O.C.可提高轉(zhuǎn)化效率20%;實(shí)驗(yàn)人員可選擇在37℃或30℃培養(yǎng)細(xì)胞,37℃條件下,菌生長速度加快,有利于提高質(zhì)粒產(chǎn)量,30℃培養(yǎng)可降低錯誤重組概率。

5. 感受態(tài)細(xì)胞最好在冰中緩慢融化。插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA,不可在冰中放置時間過長,長時間存放會降低轉(zhuǎn)化效率?;烊肽康腄NA時應(yīng)輕柔操作。

6. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?;蚋咝实倪B接產(chǎn)物可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。