1 基本說明

GV3101菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標(biāo)簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的胭脂堿型Ti質(zhì)粒pMP90 (pTiC58DT-DNA)，此質(zhì)粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pMP90 (pTiC58DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移)。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型Ti 質(zhì)粒含有篩選標(biāo)簽：gent，賦予GV3101菌株慶大霉素抗性，適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉(zhuǎn)基因操作，本公司生產(chǎn)的GV3101化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pCAMBIA2301質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>104 cfu/μg DNA。

2 基因型：

C58 (rif r) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gentr) Nopaline

3 儲(chǔ)存及使用環(huán)境

本產(chǎn)品應(yīng)保存在-80℃，不可反復(fù)凍融或放置時(shí)間過長，否則會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

進(jìn)行轉(zhuǎn)化過程中，請根據(jù)相應(yīng)溫度及無菌條件的要求進(jìn)行。

操作方法

1. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)于室溫或手心片刻待其部分融化，處于冰水混合狀態(tài)時(shí)插入冰中。

2.每100 μl感受態(tài)加入0.01-1 μg質(zhì)粒DNA（轉(zhuǎn)化效率較高，第一次使用前最好做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定所加質(zhì)粒的量），用手撥打管底混勻，依次于冰上靜置5分鐘、液氮5分鐘、37℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。

3. 加入700 μl無抗生素的LB或YEB液體培養(yǎng)基，于28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時(shí)。

4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天

（當(dāng)平板只含有50 μg/ml kan 時(shí)，28℃培養(yǎng)48 h即可；平板中同時(shí)加入50 μg/ml kan，20 μg/ml rif 時(shí)，需28℃培養(yǎng)60 h；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90 h）。

注意事項(xiàng)

1. 加入質(zhì)粒時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機(jī)物污染，轉(zhuǎn)化效率急劇下降；質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級。

2. 混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

3. 平板上陽性克隆密度過大時(shí)，由于營養(yǎng)不足，陽性克隆生長變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應(yīng)減少質(zhì)粒用量。

4. 利福平濃度不應(yīng)高于25 μg/ml，過高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長，會(huì)降低其生長速度和轉(zhuǎn)化效率。本公司感受態(tài)計(jì)算轉(zhuǎn)化效率時(shí)所用平板只含有50 μg/ml kan，若所用平板含有20 μg/ml rif則轉(zhuǎn)化效率降低到1/2。

5. 培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入Ti質(zhì)粒篩選抗生素可防止Ti質(zhì)粒丟失，但Ti質(zhì)粒篩選抗生素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時(shí)不考慮這些抗生素，Ti質(zhì)粒丟失的概率極低(可以忽略)。